影響WB實(shí)驗(yàn)的因素有什么？

WB實(shí)驗(yàn)是分子生物學(xué)中最為常見的實(shí)驗(yàn)，那么你知道影響WB實(shí)驗(yàn)的因素有什么嗎？讓我們一起來看看吧！

一、蛋白樣本制備

1. 蛋白質(zhì)的樣品制備注意以下問題：

（1）在合適的條件下，保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。

（2）選擇合適的表面活性劑和還原劑，使其形成各自多肽的溶液。

（3）盡量去除核酸，多糖，脂類等分子的干擾，裂解完畢離心之后取中層澄清溶液時(shí)避免吸到底層沉淀和上層脂類。

（4）整個(gè)制作蛋白樣本的制備過程必須在低溫下進(jìn)行，避免細(xì)胞破碎釋放出各種酶類，但是注意不要反復(fù)凍融。

（5）所抽取樣品的蛋白含量，蛋白變性是否充分等等，還有，蛋白樣品的pH值是否在7~8之間。這會(huì)直接影響到樣品濃縮的效果。此外，蛋白樣品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都會(huì)對(duì)最終結(jié)果的可靠性有影響。

2. 小分子量蛋白10KD需要的注意點(diǎn)

（1）可選擇孔徑0.22μm的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系；

（2）也可以選擇PSQ膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移，其他按步驟即可。

3. 大分子量蛋白200KD需要的注意點(diǎn)：

（1）做200kd蛋白的WB時(shí)要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時(shí)要小心；

（2）轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）；

（3）轉(zhuǎn)膜液中甲醇含量可適當(dāng)降低，推薦使用濕裝轉(zhuǎn)膜效率更高。

二、凝膠的配制

制膠關(guān)鍵是聚合時(shí)間，分離膠聚合控制在從加入10%AP和TEMED至開始凝膠，時(shí)間為10—20分鐘(未wan全凝聚)，濃縮膠最佳聚合時(shí)間為8-10min，可通過控制AP和TEMED量來控制。

1. 凝膠質(zhì)量

不連續(xù)SDS-PAGE膠對(duì)凝膠的要求較高，分離膠的pH值應(yīng)在8.8左右，而濃縮膠的pH應(yīng)在6.8左右，最好不要差過0.5個(gè)pH單位，因?yàn)檫@個(gè)pH條件是保證電泳液中的甘氨酸不電離的必要條件，也是保證能充分壓縮樣品的前提。

因此，制備凝膠的時(shí)候所用Tris-HCl緩沖液的pH值是否穩(wěn)定是很重要的。

2. 在用ddH2O壓分離膠的時(shí)候?yàn)槭裁唇?jīng)常存在中間凸的現(xiàn)象？

（1）加水時(shí)不能對(duì)著膠沖，要沿著玻璃板緩慢流行；

（2）加水滿后一定要保證上方水平面是平齊的；

（3）加膠要避免氣泡，也要避免加膠太慢而提前凝固等現(xiàn)象；

三、電泳

1. 應(yīng)待凝膠充分凝固后電泳，或者催化劑加入后充分混勻，否則條帶容易中間凹陷兩邊翹起。

2. 兩板玻璃之間排除所有的氣泡，防止條帶中間鼓兩邊下陷。

3. 加樣前離心，選擇適當(dāng)?shù)臉颖揪彌_液（盡量用新鮮配制的，這樣能保證pH值和離子強(qiáng)度的穩(wěn)定），加適量的樣品促溶劑，防止wb條帶拖尾或蛋白出現(xiàn)紋理。

4. 常用濃縮時(shí)80V，分離時(shí)100V比較好，條帶很平。

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