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    ?Tunel檢測的實驗步驟與注意事項

     更新時間:2024-01-10    點擊量:801

    TUNEL檢測是一種用于檢測細胞凋亡(程序性細胞死亡)的方法。細胞凋亡是一種重要的細胞生物學過程,它在多種生理和病理情況下發揮作用,包括發育、組織修復和免疫應答等。那么你知道Tunel檢測的實驗步驟與注意事項嗎?讓我們一起來看看吧!

    一、Tunel檢測的操作步驟

    1. 脫蠟和組織復性

    將組織在二甲苯中浸泡兩次,每次10-20分鐘。在100%乙醇中洗滌兩次,每次5分鐘。然后依次在95%,70%和50%乙醇中洗滌3分鐘。

    2. PBS洗滌和蛋白酶處理

    用200-500 µL PBS洗滌樣品兩次,每次5分鐘。排除組織中多余的PBS,并在20 µg/mL蛋白酶K溶液中孵育15分鐘。

    3. TdT標記反應緩沖液/反應混合物孵育

    配制TdT標記反應緩沖液。向每個樣品中加入50 µL反應混合物,并在濕盒中避光下37℃孵育2小時。

    4. PBS洗滌和DAPI復染

    在PBS中將樣品洗滌3次,每次5分鐘。通過在1×DAPI中孵育10分鐘對樣品進行復染。

    5. 觀察和拍照

    將樣品在PBS中洗滌3次,每次5分鐘。然后加入水性封固劑或防淬滅溶液,封住蓋玻片。最后使用熒光顯微鏡觀察,并進行熒光顯微鏡拍照觀察,紅色通道(Ex/Em=555 nm/565 nm)。

    二、注意事項

    1. 設立陽性和陰性細胞對照:

    陽性組:用DNase酶處理,誘導細胞凋亡,使3'-OH末端暴露。每次實驗只需做一個陽性組。

    陰性組:不加TdT酶,其余操作和實驗組相同。

    實驗組:除了陽性組和陰性組,所有樣本均屬于實驗組。

    2. 選擇固定液:

    建議使用4%多聚甲醛(PBS)進行固定。不建議使用乙醇和甲醇作為固定液。不要選用含有甲醇的甲醛替代品,因為這會降低標記效率,使熒光觀察困難。

    3. 貼壁細胞處理:

    貼壁細胞在加藥誘導凋亡后,細胞狀態會發生改變,形態會皺縮邊緣,貼壁粘附力降低。在對這些細胞進行實驗染色時,需要小心操作,避免吹打造成細胞脫落。特別是在多次洗滌細胞時,操作要小心輕柔。

    4. 避光操作和孵育:

    熒光基團長期暴露在普通光照下,會發生嚴重淬滅。

    在實驗操作中應盡量避光操作和孵育,以保證熒光觀察效果。

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